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mRNA生物制品質(zhì)量控制家族成員全新亮相
更新時(shí)間：2023-10-08 瀏覽次數(shù)：4298
mRNA藥物是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種到人體，利用人體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行表達(dá)合成抗原蛋白，通過抗原蛋白誘導(dǎo)和激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。
由于其具有較低的感染和突變風(fēng)險(xiǎn)，能夠同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效能好，研發(fā)和生產(chǎn)周期短，容易實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)等特點(diǎn)，目前被廣泛用于傳染性疾病、腫瘤及罕見病藥物的研發(fā)。
通過酶促體外轉(zhuǎn)錄法制備大量mRNA的工藝已經(jīng)成熟，其中規(guī)模化生產(chǎn)過程中主要涉及的工具酶有T7 RNA Polymerase、DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、無機(jī)焦磷酸酶等，這些酶的靈活使用極大的方便了生產(chǎn)流程，加速科學(xué)家們研究進(jìn)展。
T7 RNA聚合酶是由T7噬菌體DNA編碼的，一種DNA依賴性的RNA聚合酶，具有高度啟動(dòng)子專一性，可催化以T7啟動(dòng)子序列為起點(diǎn) 5’→ 3’方向的RNA合成，在mRNA藥物研發(fā)中常以其催化目的基因的體外合成，轉(zhuǎn)錄效率和產(chǎn)量高，市面上由其催化的1μg DNA模板可轉(zhuǎn)錄出150-200μg的RNA。
脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶，可以用于各種RNA樣品的處理，消化由T7 RNA聚合酶催化的體外轉(zhuǎn)錄后的DNA模板，65℃加熱10分鐘可使DNaseI失活。
RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一類能夠催化RNA降解為小分子RNA的核酸酶，廣泛存在于真核、原核生物的所有細(xì)胞和組織中，通常有強(qiáng)活性，RNA樣本中微量的RNase污染足以導(dǎo)致其降解。為了減少RNA的損失，適當(dāng)添加RNase抑制劑（RNase inhibitor）是有必要的。
RNase抑制劑是人的胎盤中存在的一種特異性核糖核酸酶(RNase)抑制劑，能夠特異地與RNase以非共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合體從而使RNase失活。
多種代謝反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生無機(jī)焦磷酸，Pyrophosphatas無機(jī)焦磷酸酶（PPase）可水解無機(jī)焦磷酸鹽，可以避免無機(jī)焦磷酸對(duì)反應(yīng)的抑制，并且提供熱力學(xué)動(dòng)力促使反應(yīng)向正向進(jìn)行，從而常用于RNA體外轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和擴(kuò)增如HDA或LAMP等溫?cái)U(kuò)增等。
尤其在工業(yè)化生產(chǎn)mRNA疫苗的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生大量的無機(jī)焦磷酸鹽，為了保證mRNA疫苗高效生產(chǎn)，可以添加無機(jī)焦磷酸酶，解除生成的無機(jī)焦磷酸鹽對(duì)反應(yīng)體系的抑制。
大多數(shù)工具酶的使用能幫助我們獲得大量的RNA，但工具酶本身對(duì)于藥物成品來說亦是一種雜質(zhì)，這些雜質(zhì)與mRNA一起通過LNP包封進(jìn)入細(xì)胞釋放后，極有可能產(chǎn)生高強(qiáng)度的免疫原性從而連帶引發(fā)mRNA的降解。以及產(chǎn)生的雙鏈RNA (dsRNA)雜質(zhì)具有潛在的免疫原性，對(duì)患者有害。因此，mRNA相關(guān)制品需要測(cè)定和控制工具酶和dsRNA的含量。
——mRNA類的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以納入外觀、pH值、含量、鑒別、序列分析、mRNA完整性、加帽率、poly（ A）長(zhǎng)度及分布、生物學(xué)活性、無菌檢測(cè)、細(xì)菌內(nèi)毒素、雙鏈 RNA殘留、溶劑殘留等檢測(cè)項(xiàng)目。
體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)知道原則（試行）
--2022年05月
——mRNA等通過體外轉(zhuǎn)錄方式制備的核酸產(chǎn)品，可通過對(duì)原材料、轉(zhuǎn)錄模板和轉(zhuǎn)錄條件的研究，控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量。轉(zhuǎn)錄用的重要原材料，如核苷酸、修飾核苷酸、 5’-帽或類似物、工具酶（如轉(zhuǎn)錄酶等）等應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制，可關(guān)注其純度和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)錄酶還需關(guān)注其保真度等。
轉(zhuǎn)錄模板的制備應(yīng)能確保模板的序列準(zhǔn)確性和純度，減少雜質(zhì)殘留。體外轉(zhuǎn)錄條件應(yīng)經(jīng)過充分的研究，提高轉(zhuǎn)錄序列的準(zhǔn)確性、均一性和完整性， 減少副反應(yīng)產(chǎn)物，如不完整 RNA、雙鏈RNA、截短RNA、長(zhǎng)鏈RNA等的形成。
體內(nèi)基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）
--2022年05月
CDE發(fā)布的指導(dǎo)原則《病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》以及美國(guó)藥典（USP）發(fā)布的《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法》的指南草案中（見下圖）指出:需要對(duì)整個(gè)工藝進(jìn)行質(zhì)量控制，保證質(zhì)量有效、安全可控。
其指導(dǎo)原則中還規(guī)定，需要對(duì)其生產(chǎn)工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)主要雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)與分析，需要更強(qiáng)大的評(píng)估方法來確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。其中對(duì)T7 RNA和dsRNA的殘留進(jìn)行了明確規(guī)定。
疫苗行業(yè)
美國(guó)藥典(USP)發(fā)布的《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法》指南草案
由于mRNA技術(shù)的應(yīng)用相對(duì)較新，在藥物研發(fā)和制造過程中指導(dǎo)mRNA質(zhì)量研究與控制方面的監(jiān)管指南和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)仍在不斷發(fā)展。
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